Биотехнология в защите растений. Практикум по выполнению лабораторных работ читать онлайн - Е. Ченикалова, М. Добронравова, Д. Павлов

Биотехнология в защите растений. Практикум по выполнению лабораторных работ

Е. В. Ченикалова

М. В. Добронравова

Д. А. Павлов

Рассматриваются технологии производства микробиологических препаратов – грибных, бактериальных и вирусных, применяемых при микробиологической защите растений.

Описаны биологические особенности и методы разведения основных энтомофагов – паразитов и хищников, используемых для борьбы с вредителями сельскохозяйственных культур открытого и защищенного грунта.

Приведены методики получения безвирусных растений картофеля, овощных культур и винограда, биотехнологические методы борьбы с болезнями растений, сорной растительностью.

Отражены методы использования дождевых червей, синантропных мух и бактерий для повышения плодородия почвы и переработки органических отходов.

Для студентов бакалавриата и магистратуры, обучающихся на агрономических специальностях, научных сотрудников, аспирантов.

Д. А. Павлов, М. В. Добронравова, Е. В. Ченикалова

Биотехнология в защите растений. Практикум по выполнению лабораторных работ

© ФГБОУ ВПО Ставропольский государственный аграрный университет, 2013

Введение

Научной основой биотехнологии являются принципы биохимии и микробиологии, молекулярной (клеточной) биологии и генетики, а также других смежных биологических дисциплин: растениеводства и селекции, энтомологии и фитопатологии, зоологии и экологии, охраны окружающей среды.

Практическое значение и конечный итог деятельности сельскохозяйственной биотехнологии как научно-практической отрасли биологии заключается в промышленном получении ценных продуктов сельскохозяйственного производства для медицины, питания, промышленности, поддержания гомеостаза среды существования человечества.

В результате изучения дисциплины студенты агрономического факультета должны знать теоретические основы сельскохозяйственной биотехнологии – принципы генной инженерии, культивирования «in vitro» органов, тканей, клеток и изолированных протопластов высших растений, использования гормонов растений и животных; методы диагностики фитопатогенных вирусов; технологию получения микробиологических препаратов для борьбы с вредными организмами; принципы использования полезных макро- и микроорганизмов в области защиты растений и охраны окружающей среды.

Студенты должны ознакомиться с технологией мелкотоннажного производства микробиопрепаратов для защиты растений от вредителей и болезней; технологиями массового разведения трихограммы, габробракона, энкарзии, хищной галлицы афидимизы, фитосейулюса и других энтомофагов; использованием дождевых червей и комнатных мух для переработки органических отходов и производства биогумуса.

Лабораторная работа № 1. Определение титра грибных препаратов

Цель работы: освоить методику определения титра биопрепаратов.

Материалы и оборудование: сухой или смачивающийся порошок боверина или жидкий препарат из биолаборатории. Набор пробирок для разведения препаратов, стеклянные палочки, мерные пипетки, колбы, камера Горяева, микроскопы, фильтровальная бумага.

При применении грибных и бактериальных биологических препаратов для защиты растений от вредителей и болезней важно следить за тем, чтобы титр рабочей суспензии соответствовал рекомендуемому (рис. 1).

Рис. 1. Энтомопатогенные грибы:

а) конидиеносцы гриба рода энтомофтора (Entomophthora sp.);

б) конидиеносцы и конидии гриба боверия (Beauveria sp.);

в) колорадский жук, пораженный мускардинозом

Титром называют количество спор гриба, находящегося в 1 мл суспензии или в 1 г сухого порошка (Бондаренко, 1983).

Особенно важно контролировать титр препарата при его изготовлении мелкими партиями в условиях производственных биолабораторий станции защиты растений.

Определение титра препарата, приготовленного на жидкой среде. Полученную из биолаборатории культуру гриба (жидкий препарат) предварительно просматривают под микроскопом для визуального определения степени насыщения конидиоспорами. При обильном спороношении полученную суспензию разбавляют в 10 и 100 раз, для чего в мерные колбы берут пипеткой по 1 мл хорошо перемешанной суспензии и доводят водой до объема 10 и 100 мл соответственно. Затем содержимое исследуемой суспензии еще раз встряхивают, стеклянной палочкой по капле наносят на две площадки камеры Горяева, покрывают покровным стеклом и хорошо притирают. Излишки жидкости удаляют фильтровальной бумагой. Камеру помещают на предметный столик, при окуляре 10x и объективе 10x находят средний ряд квадратов сетки, переводят объектив на увеличение 40х и подсчитывают число конидий. Подсчет проводят в 10 больших квадратах камеры, расположенных в среднем ряду сетки, пропустив при этом 2 первых и 2 последних квадрата. Если число конидий в большом квадрате превышает 50, для анализа берут суспензию с более высоким разведением или разбавляют в 10 раз последний вариант разбавленной суспензии.

Вычислив среднее арифметическое числа конидий в одном большом квадрате, подставляют его в формулу для определения титра (Т) маточной культуры по формуле

Т = 25 х 104 х A х P,

где А – среднеарифметическое число конидий в большом квадрате;

Р – разведение (10, 100 и т. д).

Определение титра суспензии сухого препарата. Исходя из рекомендуемой нормы применения сухого препарата, например, 1 кг/га при разведении 300 л рабочего раствора, готовят суспензию 3,3 г препарата в 1 л воды в колбе, тщательно перемешивают, фильтруют через 2 слоя марли. Полученную суспензию препарата, аналогичную применяемой в производственных условиях, подвергают анализу. Определение титра препарата проводим как в предыдущем случае.

Контрольные вопросы и задания:

1. С какой целью определяют титр грибных препаратов?

2. Опишите устройство камеры Горяева и работу с ней.

3. Расскажите о порядке работы при разведении препаратов и определении разведения.

4. По какой формуле определяется титр препарата? Что означают члены уравнения?

Лабораторная работа № 2. Технология получения и применения биопрепаратов для защиты растений от вредителей

Цель работы: ознакомиться с технологией производства и зарисовать блок-схемы получения бактериальных, грибных и вирусных препаратов, записать технологию их получения и применения.

Материалы и оборудование: образцы микробиологических препаратов, применяемых в защите растений. Насекомые, пораженные грибами, вирусными и бактериальными болезнями. Блок-схемы технологий получения препаратов.

2.1. Получение бактериальных препаратов

Промышленное производство биопрепаратов бактериального происхождения заключается в глубинном культивировании энтомопатогенных бактерий с целью получения максимального титра клеток в культуральной жидкости и накопления токсинов. Промышленные штаммы бактерий должны отвечать следующим требованиям: относиться к определенному серотипу (одному из 12 серотипов и 15 вариантов ?-эндотоксина Bacillus thuringiensis Berl.), иметь высокую вирулентность и репродуктивность, среднюю чувствительность к комплексу бактериофагов, обеспечивать высокую эффективность биопрепарата. Технология производства всех бактериальных

препаратов на основе В. thuringiensis Berl. включает следующие стадии:

1) выращивание посевного материала в лаборатории и посевном аппарате;

2) культивирование в промышленном ферментере;

3) концентрирование культуральной жидкости;

4) сушка, стандартизация и фасовка готового препарата.

Бактерии для создания препарата выращивают сначала в 3-литровых колбах (банках) с искусственной питательной средой (ИПС), а затем в посевном аппарате в условиях аэрации (0,2 л воздуха на 1 л среды в 1 мин).

Посевной материал должен содержать не менее 1,7х10

спор в 1 мл. В посевной аппарат культура добавляется в количестве 0,05 % от объема питательной среды аппарата. Температура культивирования – 28–30 °С, продолжительность культивирования – 35–40 ч.

Состав искусственной питательной среды в посевном аппарате и промышленном ферментере следующий: кормовые дрожжи (2–3 %), кукурузная мука (1–1,5 %), кашалотовый (рыбий) жир (1 %). При этом культуру доводят до стадии споруляции (образования спор у 90–95 % бактериальных клеток) (рис. 2). Если споры не требуются, то среда составляется из глюкозы технической (0,7 %), кукурузного экстракта (4 %), хлорида натрия (2 %). Состав среды влияет на соотношение спор и кристаллов эндотоксина бактерии в культуральной жидкости.

Процесс культивирования заканчивают при степени споруляции 90–95 % и титре спор в 1 мг не менее 1х10

.

Готовую культуральную жидкость перекачивают в стерильный сборник, передают на сепарацию и получают пасту влажностью 85 % с выходом около 100 кг из 1 м

культуральной жидкости и титром 20х10

спор в 1 г пасты.

Пасту собирают в отдельном сборнике. Отцентрифугированную питательную среду при необходимости используют еще 1–2 раза (многократное повторное использование его невозможно, так как в культуральной жидкости накапливаются вещества, тормозящие развитие бактерий). В дальнейшем фугат используют для производства кормовых дрожжей (цикл производства замкнутый, что важно с точки зрения экономичности и охраны окружающей среды).

Пасту направляют на приготовление стабилизированной пасты или сухого смачивающегося порошка – конечных препаративных форм биопрепарата.

Рис. 2. Энтомопатогенная бактерия

Bacillus thuringiensisBerl.:

1 – бактериальная клетка в фазе созревания; 2 – спора бактерии; 3 – ?-эндотоксин в форме кристаллического включения в бактериальной клетке

Для получения смачивающегося порошка пасту высушивают на распылительной сушилке до остаточной влажности 10 %, смешивают с каолином до стандарта – 30х10

спор в 1 г препарата. Порошок фасуют в 4-слойные герметичные мешки по 20 кг.

Стабилизированную пасту готовят, смешивая ее после сепарации с карбоксиметилцеллюлозой (КМЦ). Молекулы КМЦ, имеющие положительный заряд, за счет электростатических сил собирают на себе кристаллы и споры, заряжая их отрицательно, что способствует равномерному распределению активного начала во всем объеме пасты. Добавляют также консерванты, распределяющиеся равномерно между частицами (рис. 3).

Рис. 3. Блок-схема производства бактериальных препаратов:

1 – хранение маточного материала; 2 – выращивание посевного материала в лаборатории в качалочных колбах; 3 – выращивание маточной культуры в посевном аппарате; 4 – культивирование в промышленном ферментере; 5 – контроль на наличие свободного фага; 6 – определение степени споруляции; 7 – концентрирование культуры; 8 – повторное использование фугата (питательной среды); 9 – получение пасты; 10 – изготовление стабилизированной пасты; 11 – изготовление сухого или смачивающегося порошка

Паста не подвержена гниению и брожению, не замерзает при хранении, ей не опасно увлажнение. Это вязкая жидкость кремового цвета без запаха. Производство стабилизированной пасты экономически более выгодно. В препарат можно вводить добавки: антииспарители, смачиватели, прилипатели, приманочные вещества (аттрактанты), а также вещества, защищающие бактерий от влияния солнечной радиации. Применяются бактериальные биопрепараты (лепидоцид, дедробациллин, энтобактерин, дипел, БИП и другие) на овощных культурах с нормой расхода 1–3 кг/га, на древесных культурах с нормой 3–5 кг/га против листогрызущих вредителей (гусениц чешуекрылых, ложногусениц пилильщиков, личинок жуков-листоедов и др.). Гибель вредителей наступает на 2-10-й день.

2.2. Получение и применение грибных энтомопатогенных препаратов

Грибные препараты получают на основе представителей родов боверия (возбудитель белой мускардины), метарризиум (возбудитель зеленой мускардины), энтомофтора и ашерсония.

Промышленно культивируют в нашей стране 2 вида боверии – В. bassiana (Bals.-Criv.) Vuill, В. tenella (Delacr.) Siem., используемых против жесткокрылых. Освоено получение боверина – белого порошка, содержащего в 1 г от 1,5 до 6 млрд конидиоспор в 1 г. Кроме спор активным началом препарата является токсин боверцин, продуцируемый этим грибом-гифомицетом.

Получение боверина осуществляется двумя способами: глубинным и поверхностным культивированием. Производство глубинным способом более экономично, но при этом конидии гриба отличаются от образующихся на воздухе тонкими покровами, плохо отчленяются от вегетативного тела. Их называют гифальными тельцами или гонидиями. Они не устойчивы к высушиванию и солнечной радиации. Для устранения этого недостатка разработана более дорогостоящая ИПС (искусственная питательная среда) (рис. 4).

Технология получения боверина глубинным способом. Хранение исходного материала (штамма) проводят в лабораториях на агаризированной среде Сабуро, периодически обновляя маточную культуру. Перед началом промышленного цикла исходный штамм культивируют 3–4 суток в качалочных колбах на жидкой ИПС при 25–28 °С. Полученные конидиоспоры можно высушить и хранить до 1 года.

Приступая к промышленному получению препарата, культуру гриба выращивают в инокуляторе на ИПС. Среда состоит из кормовых дрожжей – 2 %, крахмала – 1 %, хлорида натрия – 0,2 %, хлорида марганца – 0,01 % и хлорида кальция – 0,05 %, который усиливает устойчивость конидиоспор к неблагоприятным факторам.

Культивирование в промышленном ферментере ведут 3–4 суток, при 25–28 ?С и постоянном перемешивании, с обязательной принудительной аэрацией до 2,5 объема воздуха на 1 объем среды в минуту.

В течение 1–1,5 суток дрожжи лизируются, а гриб проходит стадии роста мицелия, гонидиальную и конидиальную. К концу полного созревания культуры идет лизис мицелия и накопление в питательной среде конидий.

Рис. 4. Блок-схема получения боверина глубинным методом:

1 – хранение маточного материала; 2 – культивирование исходного штамма в качалочных колбах; 3 – получение культуры в инокуляторе; 4 – культивация в промышленном ферментере; 5 – контроль титра препарата; 6 – сепарация и фильтрация, получение пасты; 7 – высушивание пасты; 8 – стандартизация каолином до ГОСТ; 9 – применение жидкого препарата, пасты или сухого препарата

В это время проводят контроль титра культуральной жидкости. Она должна содержать от 0,3 до 1,3 млрд конидий в 1 мл. Количество гонидий – не более 3–5 %. При достижении такого титра можно приступать к применению или сепарации и фильтрации культуральной жидкости. Полученную пасту, состоящую из конидий гриба,

высушивают на распылительной сушилке, получая сухой препарат. Его стандартизируют до ГОСТ, добавляя каолин (белую глину).

Технология получения боверина методом поверхностного культивирования. Более дешевым является поверхностное культивирование гриба боверии. Оно производится на жидких или твердых средах (рис. 5).

А. На жидких средах. В состав ИПС входят отвары отходов сельскохозяйственной продукции – картофеля, сахарной свеклы, тыквы, зерна, муки и т. п. с содержанием сахаров около 7 %. При этом необходима стерилизация среды в течение 20 мин в автоклаве при 110 ?С с последующим розливом по кюветам.

После охлаждения до 40 ?С кюветы со средой засевают сухими спорами гриба или их суспензией. Среду перемешивают и укрывают полиэтиленовой пленкой для создания благоприятных условий для роста и развития гриба. Через 7-10 суток на поверхности среды образуется белая пленка мицелия с конидиями. Ее снимают, высушивают на стекле, размалывают на шаровых мельницах. Полученные конидиоспоры смешивают с наполнителем – торфом, тальком и др.

Б. На твердых средах. В этом случае питательной средой для гриба служит сусло-агаровая среда или отходы овощей, кукурузы, зерновых.

Твердый субстрат (овощи, зерно) подвергают стерилизации в течение 40 мин перегретым паром при 112 ?С. Затем охлаждают и проводят засев спорами боверии, укрывают пленкой. Экспозиция культуры составляет 12–15 суток. После получения обильного белого конидиального налета (спороношения) высушивают культуру с остатками субстрата и размалывают до мелкодисперсного порошка.

Рис. 5. Блок-схема получения боверина на жидких (А) и твердых (Б) питательных средах методом поверхностного культивирования:

1 – приготовление питательной среды; 2 – стерилизация ИПС; 3 – засев ИПС спорами боверии; 4 – экспозиция культуры; 5(А) – высушивание пленки с конидиями; 5(Б) – высушивание среды с конидиями; 6 – разведение высушенного субстрата с конидиями; 7 – хранение сухого препарата; 8 – применение

Оба способа имеют низкую производительность и применяются в местных условиях (в хозяйствах, районных биолабораториях).

Технология комбинированного получения боверина. Для ускоренного культивирования и получения конидий применяют также комбинированный способ культивации. При этом часть процесса ведут глубинным способом на жидкой ИПС до образования гонидиальной стадии гриба. Выращивание и накопление вегетативной культуры (гонидий) производят в ферментаторах с принудительной аэрацией и перемешиванием в течение 22–28 часов. Полученную культуральную жидкость разливают по кюветам и выращивают спороносные пленки методом поверхностного культивирования 4–5 суток и еще 2–3 суток для созревания спор. Высушивают пленки, размалывают их и стандартизируют препарат каолином, как при предыдущем способе.

При комбинированном способе производственный цикл составляет 11–12 суток. Применяют боверин против листогрызущих вредителей сада и леса (ложногусениц пилильщиков, личинок колорадского жука и других листоедов) с нормой расхода 1–2 кг/га и сублетальными дозами инсектицидов.

2.3. Технология получения вирусных энтомопатогенных препаратов

Вирусные препараты поражают обычно только 1 вид-мишень вредителей. Вирусные частицы в покоящейся форме устойчивы к неблагоприятным условиям окружающей среды и в виде полиэдров сохраняют активность вне насекомого до 10–15 лет. Заражение происходит только при попадании вирусных полиэдров в кишечник насекомого, где в щелочной среде оболочка полиэдра растворяется и частицы вируса проникают в клетки организма насекомого (рис. 6, 7). Размножаться вирусы могут только в живой ткани, поэтому производство препаратов требует поддержания культуры насекомых. Технология производства виринов состоит из следующих этапов: разведение насекомого-хозяина на естественном корме или питательной среде, заражение гусениц суспензией вирусных частиц (из больных особей), сбор погибших гусениц (через 7–9 дней) и подсушивание при 33–35 ?С, измельчение гусениц механически с добавлением физиологического раствора или дистиллированной воды, фильтрация взвеси, высушивание фильтрата или применение в жидком виде (рис. 8, 9).

Рис. 6. Полиэдры тополевого пилильщика (х15000)

Рис. 7. Гусеницы непарного шелкопряда, пораженные вирусом ядерного полиэдроза

Выход вирусных частиц составляет до 30 % от сухой массы гусениц.

При производстве вирина-ЭКС полиэдры осаждают центрифугированием, из осадка приготовляют суспензию в небольшом количестве дистиллированной воды, добавляют стерильный глицерин до титра 1 млрд. полиэдров в 1 мл. Препарат разливают по флаконам, в объемах, кратных гектарной норме применения.

Формы выпуска виринов – сухой порошок или масляная эмульсия на солярном масле. Титр – 1 млрд полиэдров/г. Применяют для смазывания яйцекладок непарного шелкопряда на штамбах деревьев и для опрыскивания лесов и садов.

Рис. 8. Марки виринов, применяемые в защите растений

Рис. 9. Блок-схема производства вирусных препаратов:

1 – выращивание кормовых растений для гусениц; 2 – приготовление питательной среды для фитофага; 3 – выращивание гусениц; 4 – заражение гусениц вирусом; 5 – экспозиция и высушивание погибших гусениц; 6 – приготовление жидкого вирина; 7 – высушивание препарата; 8 – применение

Вирусные препараты наиболее эффективны против гусениц младших возрастов. Их применяют методом опрыскивания, желательно в утренние или вечерние часы, чтобы предотвратить гибель вирусных частиц от прямых солнечных лучей.

Контрольные вопросы и задания:

1. Опишите технологию и блок-схемы производства бактериальных биопрепаратов.

2. Против каких вредителей и их стадий применяются бактериальные биопрепараты?

3. Опишите технологию производства грибных микробиопрепаратов на примере боверина.

4. Приведите блок-схемы получения боверина глубинным, поверхностным и комбинированным способами.

5. Против каких вредителей применяются грибные препараты?

6. Расскажите технологию производства вирусных биопрепаратов.

7. Против каких вредителей и как применяют вирины?

8. Опишите патогенез насекомых при заболевании вирозами.

Лабораторная работа № 3. Массовое промышленное разведение трихограммы

Цель работы: изучить методику массового разведения трихограммы.

Материалы и оборудование: коллекционные образцы разных видов трихограммы, яиц зерновой моли, бабочки ситотроги, технологические схемы разведения зерновой моли, мельничной огневки и трихограммы.

Трихограмма является наиболее широко применяемым у нас в стране и в мире энтомофагом. Распространены несколько видов трихограммы – представителей рода трихограмма (Trichogramma) семейства трихограмматид (Trychogrammatidae), отряда перепончатокрылых (Hymenoptera) – обыкновенная, бессамцовая, желтая, пинтои и др. (рис. 10).

Природный энтомофаг гусениц многих чешуекрылых. Распространены в южной зоне земледелия СНГ. Используется для массового размножения и выпуска на посевы методом сезонной колонизации. Впервые технологическая линия по разведению трихограммы создана учеными ВИЗР (г. Санкт-Петербург). В Ставропольском крае работает одна из 500 промышленных технологических линий.

Производится главным образом трихограмма обыкновенная (T. evanescens West.) – совочная и плодожорочная расы.

Рис. 10. Самка трихограммы заражает яйцо совки

3.1. Общая схема массового производства трихограммы

Технологический процесс массового производства трихограммы и зерновой моли схематично состоит из 8 операций:

1. Подготовка зерна к заражению зерновой молью.

2. Уход за зерном в период развития зерновой моли.

3. Создание условий для вылета из зерна бабочек моли и их сбор.

4. Содержание бабочек зерновой моли для откладки яиц.

5. Сбор яиц зерновой моли.

6. Очистка яиц зерновой моли.

7. Заражение яиц моли и размножение трихограммы.

8. Хранение трихограммы (рис. 11).

Подготовка зерна к заражению зерновой молью. При проведении этой операции преследуют двоякую цель: обеззаразить зерно от амбарных вредителей и паразитов зерновой моли и оптимально подготовить зерно к заражению гусеницами моли. Зерно должно обладать влажностью 16–17 %, быть мягким, рыхлым, не терять своих пищевых качеств. Проводят термическое или химическое обеззараживание зерна. При химической фумигации бромистым метилом зерно не увлажняется, что снижает плодовитость полученной моли на 10 %.

Рис. 11. Блок-схема разведения трихограммы (по Н. В. Бондаренко, 1989):

1 – обеззараженное зерно; 2 – зерно, заселенное яйцами ситотроги; 3 – боксы с ситотрогой; 4 – насекомопровод; 5 – пульт управления; 6 – насекомоприемник с кассетами; 7 – вытяжной шкаф для дозировки, очистки и наклеивания яиц; 8 – контейнеры-виварии с наклеенными на пластины яйцами ситотроги и пеналами с трихограммой; 9 – биоклиматические камеры с контейнерами для заселения яиц ситотроги трихограммой; 10 – политермостат для преимагинального развития трихограммы; 11 – холодильная камера для кратковременного хранения трихограммы

На практике чаще используется погружение зерна ячменя в перфорированных емкостях в горячую воду при температуре 90–95 °С.

Уход за зерном в период развития гусениц. Это сложный и трудоемкий процесс. На уход за 1 ц зерна затрачивается 2–7 человеко-дней, что составляет 50 % затрат на весь цикл размножения трихограммы. Выпускаемые промышленностью стеллажи с кюветами не механизируют операции по постоянному перемешиванию зерна, его увлажнению, контролю влажности (15–16 %) и температуры (25 °С). Зерно должно равномерно распределяться по кювете слоем не более 5 см.

Вылет бабочек зерновой моли и их сбор. Перед отрождением бабочек зараженное зерно помещают в специальные кассеты в боксы. В боксе создают оптимальные гидротермические условия: температуру 25–28 °С и влажность воздуха 80 %. Это способствует дружному вылету бабочек. Через отверстия в кассетах бабочки выходят и скапливаются в нижней конусовидной части боксов, открывающейся в общий насекомопровод с помощью автоматических задвижек. Оператор раз в сутки автоматически открывает задвижки, и бабочки из насекомопровода струей воздуха переносятся в насекомоприемник. При этой операции, однако, травмируются до 12–16 % бабочек.

Содержание бабочек зерновой моли. Вылет бабочек одной партии длится от 16–18 до 30–40 дней. Бабочек помещают в специальные кассеты – садки и содержат в термостатах с обязательной аэрацией. Под кассетами устанавливают поддон с зерном, стимулирующим откладку яиц бабочками. Плотность содержания бабочек до 200 особей на 1 см

садка. Откладка яиц и содержание одной партии бабочек в кассетах длится 4–5 суток.

Сбор и очистка яиц зерновой моли. Откладка яиц бабочками моли происходит в кассетах. При сборе яиц бабочек отсасывают вакуумным устройством, а оставшихся и погибших вместе с яйцами высыпают на механические вибросита. При вибрации сит яйца отделяются от бабочек и мусора. При этом часть бабочек, особенно попавших на сита, травмируется, что не желательно. Отбор яиц необходимо производить ежедневно, так как трихограмма заражает только свежеотложенные яйца.

Вся работа по отделению бабочек от яиц проводится в вытяжных шкафах с соблюдением индивидуальных мер защиты работающего персонала. Затем яйца дополнительно очищают струей воздуха на пневматическом классификаторе.

При оптимальном режиме содержания бабочек одной партии яйцекладка заканчивается за 20 дней с выходом продукции – до 6–8 кг яиц от 1 т зерна.

Размножение трихограммы. Для размножения трихограммы биолаборатории пользуются прозрачными емкостями с герметично закрывающимися крышками. Обычно это трехлитровые банки. На внутренние стенки их с помощью увлажнения паром наклеивают яйца моли. На промышленных биофабриках пользуются специальными контейнерами-вивариями из оргстекла, в которые вставляются стеклянные пластины, на которые так же наклеивают яйца моли.

В нижней части вивария находится пенал, в который помещают имаго трихограммы или зараженные ею яйца моли. По мере вылета трихограммы она заражает наклеенные яйца моли. Заражение ведут из расчета 1 самка трихограммы на 20 яиц моли.

Контейнеры-виварии или банки помещают в климатические камеры или на стеллажи, поддерживая заданную температуру и влажность, а также фотопериод, характерный для зоны разведения и применения паразита.

Равномерность заселения яиц трихограммой достигается переворачиванием банок через сутки и поочередным включением ламп в климатических камерах с вивариями. Трихограмма имеет положительный фототаксис и перемещается из темноты на более освещенные участки.

Через 1–2 суток в вытяжном шкафу трихограмму удаляют, а сосуды или виварии ставят в условия, близкие к природным (под навес или в инсектарий вне помещения), на время развития личинок трихограммы. После почернения зараженных яиц, что говорит о наступлении стадии предкуколки у паразита, яйца счищают со стекол, очищают в вытяжном шкафу в пневматическом классификаторе, взвешивают и фасуют в пакеты для реализации. На пакете указывают вид трихограммы, дату заражения и начала хранения, процент заселенных яиц, число особей трихограммы. Обычно в 1 г яиц содержится 80 тыс. предкуколок трихограммы.

Хранение трихограммы. Кратковременное хранение недиапаузирующей трихограммы проводят в холодильниках при +1–3 °С и относительной влажности воздуха 85–90 % в фазе предкуколки не более 40 дней, куколки – 20 дней, имаго перед вылетом – 10 дней.

Длительное хранение возможно лишь на стадии взрослой, закончившей питание личинки. Для получения диапаузирующей трихограммы однодневные яйца зерновой моли заселяют трихограммой при переменных суточных температурах 20–23 °С днем и 10 °С ночью, относительной влажности воздуха 80 % и 14–16-часовом дне. Затем дневную температуру понижают до 10 °С и яйца содержат 3–4 недели. В дальнейшем зараженные яйца хранят в холодильниках при 1–3 °С и влажности 80 %.

Для реактивации трихограммы и выхода из диапаузы яйца помещают на неделю в температурный режим 14–15 °С, а затем – 20–22 °С. Лёт паразита начинается через 7–9 дней.

В климатических камерах конструкции ВНИИБМЗР (г. Краснодар) трихограмму хранят до 4–6 месяцев слоем 2 см без потерь ее качества.

3.2. Оценка качества трихограммы

По качеству трихограмму принято делить на 4 класса: I, II, III и нестандартную. Для оценки применяется обобщенный критерий качества, учитывающий следующие

показатели: отрождение из яиц хозяина, половой индекс, плодовитость, активность поиска яиц хозяина (табл.). Трихограмма I класса имеет коэффициент активности поиска яиц хозяина более 7,5, заражает в виварии в течение суток более 30 % яиц основного хозяина – совки, ее обобщенный критерий качества равен 1–0,7. В полевых условиях она заражает свыше 78 % яиц хозяина.

Во II классе активность поиска – 5,6–7,5; в виварии заражает 20–30 % яиц, обобщенный показатель 0,5–0,7; полевая эффективность 56–78 %.

В III классе качества активность поиска яиц хозяина составляет 4,6–5,5, в лаборатории эффективность 10–20 %, обобщенный показатель – 0,3–0,5, полевая эффективность – 33–56 %. Трихограмма с более низкими показателями качества относится к нестандартной.

Таблица. Характеристики классов качества трихограммы

3.3. Повышение жизнеспособности трихограммы

Продолжительное разведение трихограммы на яйцах зерновой моли приводит к снижению качественных показателей трихограммы. Так, уже в 5–6-й генерации заражение яиц капустной совки трихограммой снижается в 10 раз. Для устранения этого явления ведутся поиски более подходящих лабораторных хозяев паразита.

Перспективным лабораторным хозяином трихограммы является мельничная огневка – эфестия. При размножении на ее яйцах плодовитость трихограммы увеличивается на 16–18 %, зараженность – на 9–10 %, продолжительность жизни паразита – на 1–2 дня по сравнению с разведением на яйцах ситотроги.

Массовое разведение эфестии проводят на отрубях, как наиболее экономичном и достаточно подходящем корме.

Гусениц эфестии выращивают в кюветах с толщиной питательного слоя 10–15 см при 20–25 °С и количестве корма на 1 гусеницу 0,4–0,6 г. Для окукливания гусениц в кюветы помещают скомканную бумагу или картон. Из-за каннибализма гусениц эфестии, способных при отрождении из незараженных яиц уничтожать зараженные трихограммой яйца, перед заражением содержат двое суток при –10

С.

Из природных хозяев трихограммы наиболее пригодна капустная совка. Разработаны методы ее массового разведения в лаборатории на естественном и искусственном корме (полусинтетической питательной среде) (рис. 12).

Для повышения генетической гетерогенности (генетической разнородности) лабораторной популяции трихограммы используют скрещивания между репродуктивно совместимыми популяциями, например краснодарской и ставропольской. После синхронизации развития трихограммы обоих популяций проводят их групповое скрещивание, затем получают два поколения на яйцах совок и массово размножают на яйцах ситотроги.

Для обновления генофонда лабораторных популяций трихограммы при биофабриках создают так называемые маточники. Это конвейер культур, на которых в естественных условиях размножаются основные хозяева трихограммы – совки. На делянках высаживают рассаду или высевают семена капусты разных сроков созревания, многолетние травы, горох, кукурузу, томаты и др. Привлекают вредителей и энтомофагов цветущими нектароносами, ловушками с патокой, искусственно заселяют гусеницами или куколками хозяев.

В сентябре – октябре осуществляют сбор зараженных яйцекладок с маточников. В лаборатории для улучшения качества популяции трихограммы проводят два ее поколения (пассажа) на яйцах совок, затем вводят в диапаузу для зимнего хранения.

Рис. 12. Схема маточника для природных хозяев трихограммы

3.4. Применение трихограммы

Выпуски яйцееда производят в поле и в садах в начале периода откладки яиц вредителем и во время массовой откладки. Например, против капустной совки, моли и белянок на крестоцветных, лугового и кукурузного мотыльков и хлопковой совки на кукурузе и томатах, комплекса листоверток, плодожорок и других чешуекрылых в саду (рис. 13).

Полученную в лаборатории трихограмму, находящуюся в яйцах моли в стадии предкуколки, куколки или начала лёта имаго, сразу необходимо выпускать. В крайнем случае можно хранить в холодильнике не более суток при +5–7 ?С.

Перед выпуском трихограммы вручную с вечера заготавливают необходимое число ведер или целлофановых пакетов по числу необходимых проходов рабочих по полю. Схема выпуска паразита 10?10 м, так как на полевых культурах имаго трихограммы расселяется в радиусе 5 м от точки выпуска.

В ведра или пакеты насыпают количество головок клевера или листьев сорняков, равное числу точек выпуска трихограммы. Рассчитывают, сколько яиц моли надо высыпать в 1 ведро (пакет). Например, получено 60 г яиц для выпуска на 10 га капусты. Ширина поля – 100 м, длина – 1000 м. Необходимо 10 ведер, в каждом по 100 головок клевера, а 60 г равномерно рассыпать в 10 ведер (по 6 г).

За ночь трихограмма отродится и распределится между головками клевера на дне ведра (пакета). Ее надо выпускать в утренние часы, до появления прямых солнечных лучей (5–7 ч утра).

Рис. 13. Схема выпуска трихограммы вручную (точками обозначены места выпуска)

Бригаду рабочих или школьников – 10 чел. – расставляют по узкому краю поля через 10 м. Агроном следит за равномерностью выпуска паразита по полю. Головку клевера с паразитом кладут в розетку листьев капусты.

На кукурузе выпуск производят в 200 точках на 1 га.

В саду трихограмму выпускают на нижних ветвях с северной стороны каждого дерева, помещая паразита также в розетку листьев.

Возможен механизированный выпуск паразита с помощью опрыскивания. В бак опрыскивателя наливают холодную воду, включают мешалку и высыпают зараженные яйца моли. При этом норму расхода надо увеличить в 2–3 раза с учетом травмирования яиц и поедания их на почве хищными жужелицами. Возможен выпуск трихограммы с помощью дельтапланов и АН-2 с необходимыми приспособлениями.

Контрольные вопросы и задания:

1. Опишите общую схему производства трихограммы на яйцах зерновой моли.

2. Какова технология получения яиц зерновой моли?

3. Какова технология размножения трихограммы на яйцах моли?

4. Назовите способы и сроки хранения трихограммы.

5. Дайте характеристику классов качества трихограммы.

6. Каковы способы повышения качества трихограммы?

7. Расскажите о способах применения (выпуска) трихограммы (с примером расчета).

Лабораторная работа № 4. Технология производства габробракона

Цель занятия: ознакомиться и записать методы разведения и применения габробракона (бракона).

Материалы и оборудование: коллекционные образцы стадий разведения бракона и его лабораторных хозяев (мельничной и вощинной огневок), микроскопы, бинокуляры, видеофильм о разведении бракона.

Бракон (габробракон) (Habrobracon hebetor Say) – представитель семейства браконид (Braconidae), отряда перепончатокрылых (Hymenoptera) (рис. 14). Природный энтомофаг гусениц многих чешуекрылых. Распространен в южной зоне земледелия СНГ. Используется для массового размножения и выпуска на посевы методом сезонной колонизации.

Рис. 14. Габробракон и зараженная его личинками гусеница

4.1. Лабораторное разведение бракона на гусеницах вощинной огневки

Питательная среда для гусениц бабочек вощинной огневки составляется из мервы (отходов воска в пчеловодстве), кукурузной и пшеничной муки, сушеной падалицы яблок, молока, сахарного песка и столовых отходов. Сначала готовят маточную смесь. К 10 кг

кукурузной муки добавляют 1,5 кг сахарного песка, смешанного с 3 литрами молока и 0,5 кг пшеничной муки 2-го сорта. Смесь автоклавируют 40 мин при 1,5 атм. Затем готовят мерву: в ведре кипятят 4 л молока, добавляют 1 кг сахарного песка, выливают в таз и добавляют 10 кг мервы. Все перемешивают и автоклавируют. Сухие фрукты стерилизуют отдельно. К столовым отходам (10 кг) добавляют 1 кг сахара и также автоклавируют.

Для выращивания гусениц вощинной огневки в 3-литровую банку кладут 100–150 г сухофруктов, 200 г маточной смеси и 100 г мервы. В банку помещают 100 гусениц вощинной моли 5-6-го возраста. Банки закрывают тканью и ставят в термостатную комнату с температурой 30–35 °С, относительной влажностью воздуха 60 %. Через 15–20 дней в банках появляются бабочки. В это время в каждую банку укладывают еще по 50-100 г мервы. Бабочки в банках откладывают яйца, из которых через 10–15 дней отрождаются гусеницы. Когда гусеницы достигают 2-3-го возраста (становятся более темными), содержимое банок пересыпают в общий деревянный садок размером 70x70x100 см с крышкой. В 1 садок высыпают примерно 30 банок. С одного садка получается примерно 20 тыс. гусениц. Сюда же добавляют ежедневно немного столовых отходов, раскладывая тонким слоем. Для сбора выходящих для окукливания гусениц в садки помещают гофрированную черную ткань или бумагу (накрывают ею питательную смесь). Гусениц выбирают из складок ткани или бумаги 2–3 раза в день. Обычно гусеницы выходят в течение месяца, но наиболее интенсивно – в первые 15 дней.

Через 10–15 дней в садок высыпают еще по 10 банок с гусеницами. Когда толщина слоя питательной смеси в садках достигает 20 см, часть гусениц огневки окукливается на дне садка. Чтобы этого не происходило, на поверхность слоя насыпают еще 150–200 г мервы. Гусениц привлекает запах воска, и они поднимаются к поверхности. Собранных гусениц пересаживают в 3-литровые баллоны для заражения браконом. Самок и самцов бракона предварительно отлавливают эксгаустером и содержат 1–2 дня в пробирках с подкормкой медовым сиропом (для оплодотворения самок).

Гусениц огневки 5–6-го возраста помещают по 300 экз. в баллоны с гофрированной бумагой. Туда же выпускают по 150 оплодотворенных самок паразита. Банки на 3 дня помещают в темноту при 27 °С для заражения гусениц. Самок паразита затем пересаживают ещё дважды в новые баллоны. С 1 банки получают в среднем 4 тыс. особей бракона.

Летом имаго бракона хранят в холодильниках до 10–15 дней, предварительно подкормив сиропом, при +5 °С. Длительное хранение паразита зимой – до 2–3 месяцев – проводят также в баллонах с гофрированной бумагой, помещая в них по 2 тыс. особей. В банки кладут кормушки из кусочков поролона, пропитанных медом. Хранение проводят при +7 °С в холодильниках.

4.2. Технологическая линия по производству бракона

Комплект этого оборудования разработан ВИЗР, рассчитан на производство за 8 месяцев вегетационного периода 5 млн особей бракона и включает 10 единиц (по 2 экз. каждой).

Установка для разведения гусениц вощинной огневки. Это климатический шкаф (камера), выполненный из антикоррозийных материалов с внутренней теплоизоляцией из пенопласта. В нем автоматически поддерживается заданная температура и относительная влажность. Установка получает питание от сети напряжением 220 В, потребляет за цикл 250 Вт. Автономное водяное питание обеспечивает ее работу в течение 30 суток. Производительность – 90 тыс. гусениц огневки за цикл (35–40 дней).

Установка для разделения гусениц по возрастам. Позволяет механизировать самую трудоемкую часть технологии производства. Работает в автоматическом и ручном режимах. За одно деление в течение 1,5–2 часов получают до 30 тыс. особей огневки, а за смену – 120 тыс. гусениц.

Установка для воспроизводства огневки. Это тоже климатический шкаф, дополнительно укомплектованный металлическими кассетами для содержания бабочек огневки.

Установка для разведения бракона. Переоборудуется из установки для разведения гусениц. Производительность – 8–9 тыс. имаго бракона в день.

Установка для сбора бракона. Повышает производительность труда в 20 раз. В ней содержат полученных имаго бракона. Автоматически поддерживается температура и влажность, фотопериод. В передней части прибора расположен световой экран, позволяющий привлекать и пневматически собирать бракона, определять половой индекс (соотношение полов). Насекомых отбирают эксгаустером в стеклянные банки или пробирки и с помощь счетного устройства и микрокалькулятора подсчитывают самцов и самок. Производительность труда до 10 тыс. насекомых в час (рис. 15).

Рисунок 15. Схема производства бракона на гусеницах вощинной огневки:

1 – подготовка маточной смеси; 2 – подготовка мервы; 3 – подготовка сухофруктов; 4 – подготовка пищевых отходов; 5 – заселение банок гусеницами; 6 – содержание отродившихся бабочек; 7 – содержание гусениц в общем садке; 8 – повторное заселение гусеницами общего садка; 9 – сбор гусениц; 10 – содержание имаго бракона до заражения гусениц; 11 – заражение гусениц с несколькими пассажами одних и тех же самок паразита; 12 – развитие личинок и куколок паразита; 13 – сбор имаго бракона; 14 – краткосрочное хранение; 15 – длительное хранение бракона; 16 – выпуск в поле

4.3. Разведение бракона на гусеницах мельничной огневки

Комплект оборудования состоит из установок для получения яиц, гусениц и бабочек хозяина и имаго паразита. Оборудование представляет собой шкафы с термостатами, которые обеспечивают заданную температуру, влажность, освещенность. В рабочих камерах осуществляется вентиляция, воздух проходит предварительную бактерицидную обработку. В установках размещены садки с насекомыми.

В период спаривания и откладки яиц бабочками в камере поддерживают температуру 25–27 °С, относительную влажность воздуха 60–70 % и красное освещение. Огневка откладывает яйца на рамки, затянутые мельничным газом или батистом. Откладка яиц продолжается 7–10 дней. В камерах, где выращиваются гусеницы, поддерживается температура 26 °С, влажность 65–75 % и темнота. При заражении браконом температуру поднимают до 28 °С. На 1 кг корма (мучных отходов и отрубей) размещают 5 тыс. яиц мельничной огневки. Корм равномерно распределен по стеллажам в камере толщиной 2–2,5 см с толщиной слоя воздуха над ним 3–4 см. Для экономии корма его разбавляют непищевыми нетоксичными наполнителями – пенопластовой стружкой, пластиковыми шариками и т. д. Максимальный выход гусениц наблюдается при ворошении субстрата, разрушающем паутинные ходы гусениц в корме. Выходящие из субстрата гусеницы заползают в различные укрытия, например скомканную бумагу, из которой их ежедневно извлекают и направляют на производство бракона или восковой огневки.

Для сбора бабочек из садков их временно обездвиживают углекислым газом (в течение 2 мин в камеру нагнетают углекислоту). Бабочки попадают в насекомосборник и восстанавливают свою активность через 2–3 мин. Продолжительность жизни бабочек 10 дней, плодовитость 140–160 яиц.

Бракона от стадии яйца до имаго разводят в одной камере. Плодовитость самок бракона 150–200 яиц. Поэтому одна группа самок заражает несколько партий гусениц. Заражение идет более эффективно в полной темноте, при 27–29 °С. В период

развития личинок бракона поддерживают температуру 25–27 °С.

Производство бракона на мельничной огневке идет эффективнее, если гусениц выращивают в 3-литровых баллонах, насыпая корм на дно слоем 5–6 см. Гусеницы получаются крупнее, чем при массовом содержании, а выход имаго бракона – выше.

4.4. Применение бракона

Нормы расхода энтомофага зависят от культуры и составляют 200–500 экз/га. Выпускают паразита на стадии имаго вручную, распределяя вдоль поля равномерно. На автомобиле медленно проезжают вдоль поля, открыв банку с вылетающими на свет паразитами.

Габробракона применяют против гусениц чешуекрылых среднего и старшего возраста (хлопковой, озимой, капустной и других совок; кукурузного стеблевого мотылька и других огневок; виноградных листоверток и других вредителей).

В системах биологической защиты культур от вредителей применение бракона производят после выпуска трихограммы в период яйцекладки и подавления гусениц младших возрастов бактериальными биопрепаратами.

Контрольные вопросы и задания:

1. Какие лабораторные хозяева используются для производства габробракона?

2. Опишите технологию выращивания бракона на гусеницах мельничной огневки.

3. Опишите технологическую линию по производству бракона на вощинной огневке.

4. Расскажите о применении бракона (сроки, нормы расхода, технология).

Лабораторная работа № 5. Технология разведения и применения хищного клеща фитосейулюса

Цель работы: ознакомиться с разведением и применением в закрытом грунте хищного клеща фитосейулюса.

Материалы и оборудование: постоянные микроскопические препараты, живая культура фитосейулюса, микроскопы, бинокуляры.

5.1. Биологические особенности фитосейулюса

Хищный клещ фитосейулюс (Phytoseiulus persimilis Ath.-Henr.) семейства фитосейид (Phytoseiidae) отряда паразитиформных клещей (Parasitihpormes) в природе обитает во влажных субтропиках Италии, Чили, Австралии, Франции. Это облигатный хищник-олигафаг: питается только различными видами паутинных клещей (рис. 16).

Самки крупнее самцов, около 1 мм длинной каплевидной формы, красно-розового цвета. После спаривания самки откладывают яйца в колонии паутинных клещей. В возрасте личинки клещ живет за счет эмбрионального желтка. Следующий возраст – пронимфа I – питается яйцами паутинных клещей, нимфа II, или дейтонимфа, наиболее прожорлива. Как и имаго, уничтожает все стадии паутинных клещей. Фитосейулюс развивается без диапаузы, требователен к повышенной температуре и влажности. Генерация его проходит в 1,5 раза быстрее, чем у жертвы. Интродуцирован в страны СНГ в XX в. из Чили для борьбы с обыкновенным и паутинным клещом в закрытом грунте. Сроки развития прямо зависят от температуры и наличия пищи.

Конец ознакомительного фрагмента.

Текст предоставлен ООО «ЛитРес».

Прочитайте эту книгу целиком, купив полную легальную версию (http://www.litres.ru/d-a-pavlov/e-v-chenikalova/m-v-dobronravova/biotehnologiya-v-zaschite-rasteniy-praktikum-po-vypolneniu-laboratornyh-rabot/?lfrom=931425718) на ЛитРес.

Безопасно оплатить книгу можно банковской картой Visa, MasterCard, Maestro, со счета мобильного телефона, с платежного терминала, в салоне МТС или Связной, через PayPal, WebMoney, Яндекс.Деньги, QIWI Кошелек, бонусными картами или другим удобным Вам способом.